Практическое занятие№2

Тема: Особенности хромосомного набора человека (количество, формы, размеры, хромосом), отличие мужского кариотипа от женского. Половые хромосомы. Тельце Барра.

Дифференциальная окраска хромосом, эухроматин, гетерохроматин.

Способы деления эукариотических клеток: митоз, мейоз и амитоз.

Сравнение митоза и мейоза, их значение при передаче генетической информации.

Гаметогенез: овогенез, сперматогенез. Строение половых клеток.

Освоены следующие компетенции:

ОК1. ОК2. ОК3. ОК4. ОК5. 

ХОД ЗАНЯТИЯ

 Задание 1. Изучите теоретический материал

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ

1. Нормативный кариотип женщины и мужчины

Совокупность хромосом клетки, характеризующаяся их числом, размером  и формой, называется кариотипом. В состав кариотипа человека входит 46 хромосом, из них 22 пары- это аутосомы, и одна пара половых: ХХ, ХY. У человека женский пол определяется наличием двух Х-хромосом. Одна X-хромосома наследуется от матери, а вторая от бабушки по отцовской линии, а мужской — одной X-и одной Y-хромосомы . X-хромосома человека содержит около 150 миллионов пар оснований, что составляет примерно 5 % ДНК в клетках женщин, 2,5 % в клетках мужчин. Несёт более 1400 генов, из них белок-кодирующих — около 800 . Y-хромосома несёт всего 78 генов). У женщин две X-хромосомы; у мужчин одна X-хромосома и одна Y-хромосома. Х -Хромосома связана с больше чем 300 болезнями (дальтонизм, аутизм, гемофилия, умственное развитие, мускульная дистрофия).  Х- хромосомы могут затрагивать мужчин, т.к. они не имеют другой Х хромосомы, чтобы дать компенсацию за ошибкиY-хромосомы. Меньше размером, чем Х-хромосома Содержит меньшее количество генов. Известны несколько признаков, гены которых только в Y-хромосомах и передаются от отца всем сыновьям, внукам  и т.д. Официально принятые формулы для изображения соответствующих кариотипов выглядят следующим образом: 46, XX; 46, XY.

Хромосома - это  интенсивно окрашенное тельце, состоящее из хроматина. Общая длина молекулы ДНК в хромосоме человека (средней по размерам) достигает  4 см, а суммарная длина этих молекул в клетке с диплоидным (двойным) набором — около 180 см. Благодаря спирализации ДНК и упаковке белками молекула ДНК укорачивается  в 5000 раз.

Хроматин (от греч. chгоmа - цвет, краска) это ДНК, связанная с белками гистонами (основными белками)  и негистоновыми белками (нейтральными или кислыми),  с ферментами: для репликации, транскрипции и репарации (восстановления поврежденных участков) ДНК. Хроматин интенсивно окрашен. Термин "хроматин" ввел В. Флемминг в 1880.

2. Строение и типы метафазных хромосом

Хромосомы формируются в начале деления клеток. Но удобнее их изучать в метафазе митоза, когда хромосомы  хорошо видны в световой микроскоп.

  Метафазные хромосомы состоят из двух сестринских хроматид (удвоенных молекул ДНК), соединенных друг с другом в области первичной перетяжки — центромеры. Центромера делит хромосому на два плеча. В зависимости от расположения центромеры хромосомы подразделяют на типы

1)  метацентрические -центромера расположена по середине и плечи  равной длины;

2)  субметацентрические- центромера смещена от середины хромосомы и одно плечо    несколько короче другого;

3)  акроцентрические -центромера расположена близко к концу хромосомы и одно плечо значительно короче другого.

В некоторых хромосомах есть вторичные перетяжки, отделяющие от плеча хромосомы участок, называемый спутником.

Для того чтобы легче разобраться в сложном комплексе хромосом, составляющих кариотип, их располагают в виде идиограммы.

Идиограмма(от греч. idios — своеобразный. gгаmma-  запись)    - это схематизированный  кариотип.  По Денверской  классификации (Денвер, США,   1960 г.) хромосомы располагаются попарно по мере убывания их величины, с учетом положения центромеры, наличия вторичных перетяжек и спутников. Исключением являются половые хромосомы, которые выделяются особо. Согласно классификации все хромосомы человека разделены на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины, и обозначаются буквами латинского алфавита от A до G . Все пары хромосом стали нумеровать арабскими цифрами.

Группа А. (1- 3) – самые большие хромосомы; 1 и 3-я- метацентрические, 2-я- субметацентрические.

Группа В. 4 и 5-я)- крупные субметацентрическиехомосомы.

Группа С (6-12-я и Х-хромосома)- субметацентрические хромосомы среднего размера.

Группа D (13-15-я)- акроцентрические хромосомы средних размеров.

Группа Е (16-18-я)- маленькие субметацентрическиехромосмы.

Группа F (19-20-я)- самые маленькие метацентрические хромосомы.

Группа G((21,22-я и Y) –самые маленькие акроцентрические хромосомы.

  Предложенная классификация позволяла четко различать хромосомы, принадлежащие к разным группам. Для окраски хромосом чаще используют краситель Романовского—Гимзы, 2% ацеткармин или 2 % ацеторсеин. Они окрашивают хромосомы целиком, равномерно (ругинный метод) и могут быть использованы для выявления численных аномалий хромосом человека (45, 47 и т. д.).

3. Хроматин и его виды

Наиболее подходящей фазой для исследования хромосом является метафаза митоза. Для изучения хромосом чаще используют препараты кратковременной культуры крови, полученные через 48 -72 ч после взятия крови.   При приготовлении препаратов хромосом к культуре клеток добавляют  колхицин, который разрушаем веретено деления и останавливает деление клетки в метафазе. Затем клетки обрабатывают гипотоническим раствором, после чего их фиксируют и окрашивают. После их исследуют с помощью микроскопа., фотографируют, полученные изображения хромосомных комплексов переносят на фотобумагу, из которой затем вырезают отдельные хромосомы для последующего анализа и систематизации.Следует отметить, что на основе указанных выше принципов удается относительно легко отнести ту или иную пару гомологичных хромосом к соответствующей группе.

Однако, при использовании обычных методов, обеспечивающих интенсивное равномерное окрашивание каждой хромосомы, во многих случаях невозможно провести разграничение отдельных хромосом внутри группы. Поэтому в дальнейшем были разработаны более сложные методы дифференциального окрашивания хромосом (Парижская классификация, 1971 г.):

Хроматин клеточного ядра подразделяется на два основных типа на эу- и гетеро хроматин. Это наследственный материал различной степени спирализации и упаковки белками различной степени конденсации.

Эухроматин(от греч. еu — полностью и сhгоmа - цвет) это- область хромосомы , которая плохо окрашивается или не окрашивается вообще в метафазных хромосомах. В эухроматиненаходятся структурные активные уникальные гены, которые контролируют развитие признаков организма.    Эухроматин менее плотно упакован и доступен для ферментов РНК-полимераз, обеспечивающих синтез и-РНК, а затем синтез белков.

В интерфазе (между делением клетки, когда ядро оформленное) находится в деспирализованном состоянии, то есть, образует невидимые в световой микроскоп фибриллы

Гетерохроматин – этоучастки хроматина, который при дифференциальном окрашивании метафазных хромосомах выглядит в виде темных полос различных размеров, состоящих из плотно упакованной молекулы ДНК. Даже в интерфазном ядре гетерохроматин в виде глыбок хорошо виден в световой микроскоп, находящиеся в течение клеточного цикла в конденсированном (компактном) состоянии. Особенностью гетерохроматиновой ДНК является крайне низкая транскрибируемость.   Переписывания информации и-РНК с данных участков не происходит. Эти гены неактивны Чаще всего он расположен вокруг ядрышка и около ядерной оболочки. Гетерохроматин бывает конститутивный (структурный) и факультативный.

Структурный гетерохроматин в интерфазном ядре спирализирован, плотно упакован  в метафазных хромосомах постоянно обнаруживается вокруг центромеры во всех 46 хромосомах (составляет около 13 % от генома). Расположение темных полос для каждой пары хромосом строго индивидуально. Структурный гетерохроматин конденсирован всегда Функция структурного гетерохроматина в целом пока неясна.

Факультативный гетерохроматин- это спирализованный эухроматин, появляется в интерфазном ядре не всегда и  присутствует только в одной из гомологичных хромосом. Пример гетерохроматина такого типа — вторая X-хромосома у человека, которая в ходе раннего эмбриогенеза инактивируется вследствие её необратимой конденсации. Благодаря этому женские и мужские организмы уравновешиваются по количеству функционирующих генов,  сцепленных с полом, так как у мужчин одна-X-хромосома и одна доза генов Х-хромосомы.

Впервые  обнаружил половые различия в строении интерфазных ядер в  1940 г. М. Барр. Оказалось, что в ядре соматических клеток у женщин обнаруживаются темно-окрашенная хроматиновая глыбка, прикрепленная к оболочке ядра. Впоследствии эти хроматиновые глыбки были названы половым хроматином, или тельцем Барра. Тельце Барра – это инактивированная Х-хромосома  или половой хроматин Тельце Барра можно обнаружить в большом количестве клеток во всех тканях женщин. Наиболее простой метод определения полового хроматина связан с окраской ацеторсеином клеток слизистой оболочки рта, полученных путем соскоба с внутренней поверхности щеки при помощи шпателя. Материал соскоба распределяют по поверхности предметного стекла и на 1 - 2 мин наносят, краситель. Затем покрывают препарат покровным стеклом и, слегка нажимая на него, удаляют остаток красителя фильтровальной бумагой. Окрашенный препарат изучают с помощью светового микроскопа с иммерсионным объективом. При этом половой хроматин выявляется под ядерной оболочкой клетки в виде плотного образования (тельца) различной формы, чаще всего овальной или треугольной (рис. 7.4).

В норме половой хроматин обнаруживается в ядрах большинства клеток (50 - 70 %) у лиц женского пола, тогда как у индивидуумов мужского пола он встречается очень редко (0 - 5% всех клеток). При изменении числа X-хромосом в кариотипе индивидуума меняется и содержание полового хроматина в его клетках.

Рис.1. Ядра клеток буккального эпителия

а - ядро без глыбки половогохроматина,

б - с глыбкой полового хроматина

Связь между количеством X-хромосом (N) и числом телец полового хроматина (л)можно выразить в виде формулы  n = N - 1

Определение содержания X-хроматина в клетках человека в клинической практике обычно проводят в следующих ситуациях: 1) при цитологической диагностике пола в случаях его реверсии (гермафродитизм); 2) с целью установления пола будущего ребенка в процессе дородовой диагностики (при высоком риске заболевания, сцепленного с полом); 3) для предварительной диагностики наследственных заболеваний, связанных с нарушением числа половых хромосом.

Рис. 2 Ядра клеток слизистой оболочки ротовой полости человека с различным числом телец Барра

Для диагностики синдромов, связанных с нарушениями в системе половых хромосом, используют микроскопический анализ интерфазных ядер. Отсутствие тельца Барра у женщин и присутствие у мужчин тельца Барра  позволяет диагностировать количественные аномалии хромосом по половой паре хромосом.  Правильно ли утверждение: тельце Барра присутствует только в клетках женщин?

4. Структурные элементы в дифференцировано окрашенных хромосомах(объяснение проводиться на  рисунке 12 хромосомы).

Фенилпирровиноградная олигофрения - моногенное заболевание связанное с нарушением активности фермента фенилаланингидроксилазы вызывается мутацией гена картированого 12g 12

На примере 12-й дифференциально окрашенной хромосомы разберем из каких структурных элементов она состоит. Хромосома состоит из двух хроматид.  В коротком плече р выделяют 1 район, в котором дифференцируют 3 сегмента с разной интенсивностью окраски. Эти сегменты пронумерованы от центромеры к теломере. В длинном плече g  выделяют два района, первый из которых содержит 5 сегментов, а второй 4 Символическая запись 12g 12 означает, что имеется в виду 2 сегмент первого района длинного плеча хромосомы.

Сложные методы дифференциального окрашивания хромосом (Парижская классификация, 1971 г.)R-, G-, Q-, С-методы, и способ дифференциального окрашивания хроматид бромдезоксиуридином, при которых окраска распределяется не равномерно по всей длине исследуемой структуры, а в виде отдельных сегментов. Такие сегменты являются идентичными в хромосомах гомологичной пары, но отличаются в случае гетерологичных хромосом.  При дифференциальной окраске хромосом в каждой парс хромосом выявляется характерный только для нее уникальный порядок чередования темных и светлых полос гетеро- и эухроматина. 

G-метод: по длине хромосомы выявляется ряд окрашенных и неокрашенных полос. Чередование этих полос и их размеры строго индивидуальны и постоянны для каждой пары гомологичных хромосом, поэтому при дифференциальной окраске можно легко определить, к какой паре относится хромосома, если даже пары сходны между собой по размерам и форме. При Q-окрашивании флюоресцентным красителем (акрихином, акрихин-ипритом), с помощью ультрафиолетового излучения можно выявлять оттенки интенсивности окраски и четко дифференцировать Y-хромосому. Характер сегментированности хромосом при Q- и G-окрашиваниях обычно является сходным. При использовании флюорохромовдля R-окрашивания удается четко определять концевые (теломерные) районы хромосом, при этом картина чередующихся окрашенных и светлых сегментов будет обратной по сравнению с той, которую наблюдают при G- и Q-окрашивании. Для установления локализации околоцентромерного и других участков гетерохроматина также применяется специальное окрашивание - (С-окрашивание), позволяющее выявлять соответствующий хромосомный полиморфизм.

 Задание 2. Изучите по схемам видимое строение хромосом (рисунок 1, 2) и зарисуйте особенности их   морфологии.

 Задание 3. Изучите классификацию и номенклатуру равномерно окрашенных хромосом  (рисунок 3,4). Ответьте на вопросы:

• Какая классификация хромосом принята в качестве основной?
• В чем заключаются возможности Денверской классификации хромосом?
• По какому принципу разделены хромосомы в этой классификации?

   Классификация и номенклатура равномерно окрашенных хромосом человека впервые были приняты в 1960 году в г.Денвере. Согласно классификации все хромосомы человека разделены на 7 групп, расположенных в порядке уменьшения их длины, и обозначаются буквами латинского алфавита от A до G . Все пары хромосом стали нумеровать арабскими цифрами.

Группа А. (1- 3) – самые большие хромосомы; 1 и 3-я- метацентрические, 2-я- субметацентрические.

Группа В. 4 и 5-я)- крупные субметацентрическиехомосомы.

Группа С (6-12-я и Х-хромосома)- субметацентрические хромосомы среднего размера.

Группа D(13-15-я)- акроцентрические хромосомы средних размеров.

Группа Е (16-18-я)- маленькие субметацентрическиехромосмы.

Группа F(19-20-я)- самые маленькие метацентрические хромосомы.

Группа G((21,22-я и Y) –самые маленькие акроцентрические хромосомы.

  Предложенная классификация позволяла четко различать хромосомы, принадлежащие к разным группам.

 Задание 4.  Изучите методы цитологического окрашивания хромосом

Наиболее подходящей фазой для исследования хромосом является метафаза митоза. Для изучения хромосом чаще используют препараты кратковременной культуры крови, полученные через 48 -72 ч после взятия крови.   При приготовлении препаратов хромосом к культуре клеток добавляют  колхицин, который разрушаем веретено деления и останавливает деление клетки в метафазе. Затем клетки обрабатывают гипотоническим раствором, после чего их фиксируют и окрашивают.

 А) Полное окрашивание хромосом. Для окраски хромосом чаще используют краситель Романовского—Гимзы, 2% ацеткармин или 2 % ацетарсеин. Они окрашивают хромосомы целиком, равномерно (ругинный метод) и могут быть использованы для выявления численных аномалий хромосом человека (45, 47 и т. д.).

 Б) Дифференцированное окрашивание хромосом.

Для получения детальной картины структуры хромосом используют различные способы дифференциального окрашивания. Один из них - G-метод: по длине хромосомы выявляется ряд окрашенных и неокрашенных полос. Че­редование этих полос и их размеры строго индивидуальны и постоянны для каждой пары гомологичных хромосом. Например, хромосомы 13, 14, 15-й пар трудно отличить при равномерной окраске, а при дифференциальной - рисунок исчерченности (чередование и размер темных и светлых полос) неодинаков (рисунок 6).

Выполните задания

 Задание 5. Расшифруйте условные обозначения и отметьте стрелками соответствующие сегменты хромосом и зарисуйте из в тетрадь:

а) 3р13; б) 3g29; в) 3р26; г) 4р15; д) 4g26;   е) 11 р 14; ж) 11g 26

С помощью современных молекулярно-генетических методов в ДНК обнаружены:

а) локус  гена WHCR – ген синдрома Вольфа (низкий рост, микроцефалия, судорожные припадки, множественные аномалии развития), имеющего координаты 4 р16; 

б) локус гена NF – ген нейрофиброматоза 2 типа, имеющего координаты 22 g12

в) локус гена CLS – ген синдрома КоффинаЛоури (умственная отсталость, «куриная грудь», «нос боксера», гипертелоризм), Хр22;

г) локус гена GEY – зеленый/синий цвет глаз, имеющего координаты 19 р13

д) локус  гена NPC- болезнь Нимана-Пика , имеющего координаты 18 g 11- g 12; 

е) локус  гена онкогена ras, имеющего координаты 3р25;

ж) локус гена ОFS1, CL – расщепление губы с  расщеплением или без расщепления неба, 6р24

з) локус гена NF – ген нейрофиброматоза 2 типа, имеющего координаты 22 g12 

Рисунок 6 - Схематическое изображение дифференциальной окраски хромосом человека по G-  методу

 Задание 6. Заполните таблицу «Сравнение гаметогенеза»

 Задание 7. Сделайте вывод по работе.